国产欧美日韩综合精品一区二区三区_永远的第一名原著小说_我不想当妖皇的日子_傻丫头的华丽蜕变_好想住你隔壁出书全文免费阅读

js5金沙2004cm_首頁(歡迎您)

北理工課題組在CRISPR系統(tǒng)元件篩選方面取得重要進(jìn)展


近日,js5金沙2004cm霍毅欣教授團(tuán)隊(duì)在CRISPR/Cas9系統(tǒng)功能性sgRNA突變體篩選方面取得重要進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“Identification of functional sgRNA mutants lacking canonical secondary structure using high-throughput FACS screening”為題發(fā)表在Cell 子刊《Cell Reports》上(https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114290)。該工作以js5金沙2004cm為第一通訊單位,博士生梁澤宇為第一作者,霍毅欣教授為通訊作者。

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的基因改造技術(shù),該系統(tǒng)的主要元件為Cas9蛋白與sgRNA。在sgRNA的引導(dǎo)下,Cas9-sgRNA二元復(fù)合體可以識別特定的DNA靶點(diǎn),并在該位點(diǎn)使DNA序列產(chǎn)生雙鏈斷裂。在對底盤菌株進(jìn)行代謝工程改造時,往往需要對多個目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行基因操作,而在CRISPR系統(tǒng)中共表達(dá)多個相同的sgRNA易觸發(fā)遺傳不穩(wěn)定性導(dǎo)致序列丟失?,F(xiàn)有的sgRNA篩選系統(tǒng)通常是基于CRISPRi系統(tǒng)設(shè)計(jì)的,因此無法保證所篩選得到的sgRNA突變體與Cas9蛋白形成復(fù)合體后仍具有核酸酶活性 (圖1)。相同sgRNA突變體與Cas9結(jié)合后抑制活性與核酸酶活性不一致這一現(xiàn)象有研究提及,但尚未得到系統(tǒng)分析和詳細(xì)報(bào)道。為了評價現(xiàn)有的sgRNA突變體是否可以用于基因改造,我們系統(tǒng)性地設(shè)計(jì)了鑒定sgRNA突變體與Cas9蛋白結(jié)合后DNA結(jié)合活性與核酸酶活性的系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)相同的sgRNA序列兩種活性存在不一致的情況。因此我們需要得到與現(xiàn)有的野生型sgRNA序列差異較大的sgRNA突變體。

image.png

圖1 現(xiàn)有sgRNA突變體活性分析

本團(tuán)隊(duì)長期從事CRISPR系統(tǒng)機(jī)制探究以及高效基因編輯方法學(xué)開發(fā),2019年以“CRISPR-Cas9-assisted native end-joining editing offers a simple strategy for efficient genetic engineering in Escherichia coli”為題,在領(lǐng)域頂級期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》上發(fā)表。該工作報(bào)道了一種基于原核體內(nèi)的微同源末端重組系統(tǒng)的CRISPR/Cas9基因編輯方法,是一種最簡單的基因編輯方法。我們利用該研究的DNA修復(fù)方法設(shè)計(jì)了一種基于生長和/或熒光激活細(xì)胞分選(FACS)的高通量sgRNA突變體正向篩選系統(tǒng)。我們首先在篩選標(biāo)簽中插入一段可以被識別的DNA靶點(diǎn)序列,并引入一段同源序列。當(dāng)sgRNA突變體與Cas9蛋白形成二元復(fù)合體,并在有活性的sgRNA突變體引導(dǎo)下結(jié)合至DNA靶點(diǎn)序列形成三元復(fù)合體,激活Cas9蛋白核酸酶活性后,在所設(shè)計(jì)的DNA靶點(diǎn)將會出現(xiàn)雙鏈斷裂,激活原核細(xì)胞內(nèi)的同源修復(fù)系統(tǒng)。該同源修復(fù)系統(tǒng)利用我們所引入的同源序列進(jìn)行篩選標(biāo)簽的修復(fù),使得細(xì)胞在篩選條件下出現(xiàn)可被篩選的表型,如可在抗性平板上生長或是通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選 (圖2)。

圖2 sgRNA突變體篩選體系構(gòu)建與驗(yàn)證

之后我們根據(jù)sgRNA的結(jié)構(gòu),分區(qū)進(jìn)行突變庫構(gòu)建與篩選,將篩選得到的6個單區(qū)有活性的突變序列進(jìn)行隨機(jī)組合。利用該篩選系統(tǒng),我們得到了具有突變率超過50%的sgRNA突變體序列,并且這些sgRNA突變體與Cas9蛋白形成復(fù)合體后仍能夠在細(xì)胞內(nèi)保持與野生型水平相當(dāng)?shù)暮怂崦富钚?。通過結(jié)構(gòu)模擬,我們發(fā)現(xiàn)這些sgRNA突變體由于具有高的序列突變率而失去了公認(rèn)的典型二級結(jié)構(gòu),這表明Cas9蛋白與sgRNA突變體可以相互適應(yīng)并進(jìn)行結(jié)構(gòu)校正。進(jìn)一步,我們將高通量篩選系統(tǒng)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合。通過高通量測序,最終得到了大量sgRNA突變體序列,并且這些突變體序列均與野生型sgRNA序列有巨大差異 (圖三)。

圖3 sgRNA突變體篩選結(jié)果

我們使用這些sgRNA突變體開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的多靶點(diǎn)基因編輯工具箱,可以同時實(shí)現(xiàn)至多4個位點(diǎn)的基因敲除以及堿基突變。利用該基因編輯工具箱,我們實(shí)現(xiàn)了底盤細(xì)胞快速工程化改造,得到一系列敲除了不同副途徑的異丁醇生產(chǎn)菌株,并實(shí)現(xiàn)異丁醇高產(chǎn)菌株的構(gòu)建成功將化學(xué)品異丁醇的搖瓶產(chǎn)量提高到了13.9g/L。為了拓展該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍,我們利用該工具箱構(gòu)建菌株突變庫,并與本團(tuán)隊(duì)所報(bào)道的生物傳感器BmoR相結(jié)合,篩選得到1,3-PDO高產(chǎn)菌株(圖4),并且與野生型相比突變菌株的產(chǎn)量提高了4.5倍。

圖4 sgRNA突變體在代謝工程中的應(yīng)用

此項(xiàng)工作以js5金沙2004cm為唯一通訊單位,得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的支持,也感謝js5金沙2004cm生物與醫(yī)學(xué)工程公共實(shí)驗(yàn)中心的支持。


分享到:

XML 地圖 | Sitemap 地圖